Genetica molecolare umana 4/ed. [Strachan - Zanichelli]
- ISBN/EAN
- 9788808059437
- Editore
- Zanichelli
- Formato
- Cartonato
- Anno
- 2012
- Edizione
- 4
- Pagine
- 896
Disponibile
100,00 €
La sequenza “finita” del genoma umano è stata pubblicata nel 2004 e da allora siamo entrati in un’era in cui ogni anno viene prodotta un’enorme quantità di dati, grazie alle tecnologie di sequenziamento parallelo del DNA: probabilmente il genoma di un enorme numero di organismi e di singoli individui sarà stato completato prima della prossima edizione di questo libro.
Un altro strumento d’indagine in grande espansione è l’analisi bioinformatica: si stanno allestendo potenti programmi per confrontare il nostro genoma con quello di un crescente numero di altri organismi. La genomica comparata ci sta aiutando a comprendere le forze che hanno modellato l’evoluzione del genoma umano e quello di molti organismi modello importanti per la ricerca e per le applicazioni biomediche. Questi studi sono già stati molto utili per definire le parti che si sono conservate, e sono quindi presumibilmente più importanti, del nostro genoma, consentendo di identificare le componenti che cambiano più velocemente e ciò che ci rende unici.
L’analisi trascrittomica basata sulle sequenze è un’importante strumento per capire la funzione dei geni umani nell’ambito di progetti come ENCODE, che si propone di creare un’enciclopedia degli elementi di DNA a funzione nota; quando si sarà accumulata un’adeguata massa di dati sulla funzione genica, si avranno le basi per un reale sviluppo della biologia dei sistemi.
Negli studi relativi alle malattie, la ricerca in tutto il genoma di varianti per numero di copie ha consentito di identificare l’origine dei problemi che affliggono singoli pazienti e di scoprire nuove sindromi dovute a microdelezioni e microduplicazioni.
Il sequenziamento dell’intero genoma espresso è sul punto di spiegare la causa di molte condizioni recessive rare. Anche le nostre conoscenze sul cancro subiranno un importante avanzamento: la prima sequenza completa di tumori sta cominciando a rivelare lo scenario della carcinogenesi con un dettaglio mai raggiunto prima.
I ricercatori sono ora in grado di identificare fattori genetici di suscettibilità per malattie comuni, ma è risultato chiaro che le varianti rivelate da studi di associazione estesi all’intero genoma sono in grado di spiegare solo una minima parte della suscettibilità genetica alla maggior parte delle malattie complesse.
Genetica umana molecolare fornisce un quadro coerente per comprendere tutti questi argomenti attuali e in rapido mutamento, fornendo un’ossatura di principi più che un elenco di fatti e stabilendo un ponte tra i testi di base e la letteratura scientifica.
Gli autori
- Tom Strachan è direttore scientifico dell’Institute of Human Genetics e professore di Genetica umana molecolare presso la Newcastle University (UK).
- Andrew Read è professore emerito di Genetica umana presso la Manchester University (UK).
Maggiori Informazioni
| Autore | Strachan Tom; Read Andrew |
|---|---|
| Editore | Zanichelli |
| Anno | 2012 |
| Tipologia | Libro |
| Lingua | Italiano |
| Indice | CAPITOLO 1 Struttura degli acidi nucleici ed espressione genica 1.1 DNA, RNA e polipeptidi 2 L’informazione genetica fluisce quasi esclusivamente in una direzione: DNA → RNA → polipeptide 2 Gli acidi nucleici e i polipeptidi sono sequenze lineari di semplici unità ripetute 3 Acidi nucleici 3 Polipeptidi 3 Il tipo di legame chimico determina la stabilità e la funzione della molecola 5 BOX 1.1 L’IMPORTANZA DEL LEGAME IDROGENO NEGLI ACIDI NUCLEICI E NELLE PROTEINE 7 1.2 Struttura degli acidi nucleici e replicazione del DNA 7 Struttura del DNA e dell’RNA 7 La replicazione è semi-conservativa e semi-discontinua 10 Le DNA polimerasi a volte partecipano alla riparazione e alla ricombinazione del DNA 10 BOX 1.2 PRINCIPALI CLASSI DI PROTEINE COINVOLTE NELLA REPLICAZIONE DEL DNA 11 Molti virus hanno genomi a RNA 12 1.3 La trascrizione dell’RNA e l’espressione genica 14 La maggior parte dei geni è espressa per dar origine a polipeptidi 15 Le tre RNA polimerasi eucariotiche trascrivono diversi tipi di geni per gli RNA 16 1.4 La maturazione dell’RNA 17 Le regioni non necessarie sono rimosse dal trascritto primario 17 Alle estremità della maggior parte dei trascritti prodotti dall’RNA polimerasi II sono aggiunti specifici nucleotidi 19 Formazione del cappuccio al 5’ 19 Poliadenilazione al 3’ 20 I trascritti degli rRNA e dei tRNA vanno incontro ad un ampio processamento 21 1.5 Traduzione, processamento post-traduzionale e struttura delle proteine 22 Gli RNA messaggeri sono decodificati a dare specifici polipeptidi 22 Il codice genetico è degenerato e non completamente universale 24 Processamento post-traduzionale: modificazioni chimiche di aminoacidi e taglio dei polipeptidi 25 Aggiunta di carboidrati 25 Aggiunta di gruppi lipidici 26 Il taglio post-traduzionale 26 L’a-elica 28 Il foglietto b pieghettato 28 La curva b 29 Strutture più complesse 29 La complessa relazione tra sequenza aminoacidica e struttura proteica 27 L eT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 30 CAPITOLO 2 Struttura e funzione del cromosoma 2.1 La ploidia e il ciclo cellulare 32 2.2 Mitosi e meiosi 34 La mitosi è il tipo normale di divisione cellulare 34 La meiosi è una forma specializzata di divisione cellulare che produce spermatozoi e ovuli 35 Assortimento indipendente 36 Ricombinazione 37 L’appaiamento X-Y 38 La mitosi e la meiosi hanno importanti somiglianze e differenze 39 2.3 Struttura e funzione dei cromosomi 39 Il DNA cromosomico è ripiegato in modo gerarchico 40 La cromatina interfasica varia nel grado di compattazione 41 Ogni cromosoma ha il suo territorio specifico nel nucleo interfasico 42 I centromeri svolgono un ruolo centrale nei movimenti dei cromosomi ma si sono evoluti in modi molto diversi in diversi organismi 42 BOX 2.1 COMPONENTI DEL FUSO MITOTICO 43 La replicazione dei cromosomi nei mammiferi è basata sull’uso flessibile di molteplici origini di replicazione 44 I telomeri hanno strutture specializzate per preservare le estremità dei cromosomi lineari 45 Struttura, funzione ed evoluzione dei telomeri 45 La telomerasi e il problema della replicazione delle estremità dei cromosomi 46 2.4 Lo studio dei cromosomi umani 48 L’analisi dei cromosomi è più facile in mitosi che in meiosi 48 I cromosomi vengono identificati per la loro dimensione e il tipo di bandeggio 49 Bandeggio cromosomico 49 Referto delle analisi citogenetiche 51 La citogenetica molecolare localizza sui cromosomi specifiche sequenza di DNA 51 BOX 2.2 NOMENCLATURA DEI CROMOSOMI UMANI 51 Ibridazione cromosomica fluorescente in situ (FISH) 52 Chromosome painting e cariotipo molecolare 53 L’ibridazione genomica comparativa (CGH) 54 2.5 Anomalie cromosomiche 55 Le anomalie numeriche dei cromosomi implicano la perdita o l’acquisizionedi interi cromosomi 56 Poliploidia 56 Aneuplodia 57 Mixoploidia 57 Conseguenze cliniche 57 Molte anomalie nella struttura dei cromosomi derivano da errori nella riparazione o nella ricombinazione 59 Diversi fattori contribuiscono alle conseguenze cliniche delle anomalie strutturali dei cromosomi 60 Una scorretta origine parentale dei cromosomi può determinare uno sviluppo anormale o malattie 62 • Conclusioni 63 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 64 CAPITOLO 3 I geni nelle famiglie e nelle popolazioni BOX 3.1 NOMENCLATURA DEI GENI E DEGLI ALLELI NELL’UOMO 66 3.1 Eredità monogenica e multifattoriale 66 BOX 3.2 DATABASE DEI CARATTERI MENDELIANI E DELLE MALATTIE NELL’UOMO 67 3.2 Modelli di alberi genealogici mendeliani 68 Esistono cinque tipi base di alberi genealogici di tipo mendeliano 68 Inattivazione del cromosoma X 69 BOX 3.3 RIASSUNTO DEI TIPI DI EREDITÀ 71 Mosaicismo dovuto all’inattivazione dell’X 71 Il cromosoma Y è povero di geni 72 I geni della regione pseudoautosomica 73 Malattie dovute a mutazioni del DNA mitocondriale 73 È difficile stabilire con precisione il tipo di eredità in base a un unico albero genealogico 74 Il rapporto giusto: il problema della distorsione nel rilevamento 75 BOX 3.4 CALCOLO E CORREZIONE DEL RAPPORTO DI SEGREGAZIONE PER UN CARATTERE RECESSIVO 76 La relazione tra i caratteri mendeliani e le sequenze geniche 76 Eterogeneità del locus 77 Eterogeneità clinica 78 3.3 Complicazioni degli alberi genealogici mendeliani semplici 78 Una condizione recessiva comune può dare un albero genealogico di tipo dominante 78 Una condizione dominante non si manifesta 79 Penetranza legata all’età in malattie a insorgenza tardiva 80 Molte condizioni hanno espressività variabile 80 Anticipazione 81 Imprinting 82 La letalità maschile può complicare gli alberi per caratteri legati al sesso 82 L’inbreeding complica l’interpretazione degli alberi 83 Nuove mutazioni e il mosaicismo complicano l’interpretazione degli alberi 83 Mosaici 84 Chimere 85 3.4 La genetica dei caratteri multifattoriali: la teoria della soglia poligenica 86 Agli inizi del XX secolo ci fu una controversia tra i fautori dell’eredità mendeliana e di quella quantitativa 86 La teoria poligenica spiega la determinazione genetica dei caratteri quantitativi 87 La regressione sulla media 88 Gli assunti nascosti 89 L’ereditabilità misura la proporzione della variabilità totale di un carattere che dipende da differenze genetiche 89 Ereditabilità fraintesa 90 Il modello soglia estende la teoria poligenica ai caratteri dicotomici 90 La teoria della soglia e la stima del rischio di ricorrenza 91 La consulenza nelle condizioni non mendeliane è basata su un rischio empirico 91 3.5 I fattori che influenzano le frequenze alleliche 92 Un esperimento virtuale: estrarre alleli dal pool genico 93 La legge di Hardy-Weinberg collega le frequenze alleliche alle frequenze genotipiche 93 La legge di Hardy-Weinberg nella consulenza genetica 93 BOX 3.5 LE RELAZIONI TRA FREQUENZE ALLELICHE E GENOTIPICHEIN UNA POPOLAZIONE ALL’EQUILIBRIO DI HARDY-WEINBERG 93 Inincrocio (inbreeding) 94 BOX 3.6 GLI EFFETTI DELL’ININCROCIO (inbreeding) 95 Altre cause di scostamento dalle relazioni di Hardy-Weinberg 96 Le frequenze alleliche possono variare nel tempo 97 Stima dei tassi di mutazione 97 Il vantaggio dell’eterozigote 98 BOX 3.7 SELEZIONE A FAVORE DELL’ETEROZIGOTE NEL CASO DELLA FIBROSI CISTICA 98 • Conclusioni 99 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 99 CAPITOLO 4 Cellule e comunicazione cellula-cellula 4.1 Struttura e diversità cellulare 102 I procarioti e gli eucarioti rappresentano una suddivisione fondamentale tra le forme di vita cellulare 102 BOX 4.1 ORGANIZZAZIONE INTRACELLULARE DELLE CELLULE ANIMALI 103 La straordinaria diversità delle cellule nel corpo 105 Le cellule germinali sono specializzate per la funzione riproduttiva 105 Il contenuto di DNA può variare nelle cellule di un singolo organismo multicellulare 107 4.2 Adesione cellulare e formazione dei tessuti 108 Le giunzioni cellulari regolano il contatto tra le cellule 109 Giunzioni strette 109 Giunzioni cellulari di ancoraggio 109 Giunzioni cellulari comunicanti 110 La matrice extracellulare regola il comportamento cellulare e serve da impalcatura per sostenere i tessuti 111 Tipi cellulari specializzati sono organizzati in tessuti 111 Epitelio 112 Tessuto connettivo 112 Tessuto muscolare 113 Tessuto nervoso 113 4.3 Principi della segnalazione cellulare 114 Le molecole segnale si legano a recettori specifici nelle cellule riceventi, inducendo un cambiamento del comportamento cellulare 114 BOX 4.2 STRUTTURA DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE 116 Alcune molecole segnale si legano a recettori intracellulari che attivano direttamente i geni bersaglio 117 La segnalazione attraverso recettori sulla superficie cellulare spesso implica una cascata di chinasi 117 Le vie di trasduzione del segnale usano spesso delle piccole molecole segnale come intermediari intracellulari118 Il segnale sinaptico è una forma specializzata di segnalazione cellulare che non richiede l’attivazione di fattori di trascrizione 120 4.4 Proliferazione cellulare, senescenza e morte cellulare programmata 121 La maggior parte delle cellule negli animali adulti non si divide, ma alcuni tessuti e cellule si rinnovano rapidamente 121 I mitogeni promuovono la proliferazione cellulare superando i meccanismi che frenano la progressione del ciclo cellulare in G1 122 I limiti della proliferazione cellulare e il concetto di senescenza cellulare 124 Un gran numero di cellule umane è programmato in modo naturale per morire 124 L’importanza della morte cellulare programmata 125 L’apoptosi viene effettuata dalle caspasi in risposta a segnali di morte o a un prolungato stress cellulare 126 Vie estrinseche: segnalazione attraverso recettori di morte sulla superficie cellulare 127 Vie intrinseche: risposte intracellulari a stress cellulari 127 4.5 Cellule staminali e differenziamento 128 La specializzazione cellulare implica una serie di decisioni gerarchiche guidate 128 Le cellule staminali sono delle rare cellule progenitrici che si autorinnovano 129 Cellule staminali tissutali consentono di reintegrare tessuti adulti 130 Nicchie di cellule staminali 131 Rinnovamento versus differenziamento delle cellule staminali 132 Le cellule staminali embrionali e le cellule germinali embrionali sono pluripotenti 132 Origine delle cellule staminali embrionali coltivate 132 BOX 4.3 DIVISIONE CELLULARE ASIMMETRICA 133 Test di pluripotenza 134 Cellule germinali embrionali 134 4.6 Cellule del sistema immunitario: la funzione attraverso la diversità 135 Il sistema immunitario innato fornisce una risposta rapida basata su una modalità generale di riconoscimento dei patogeni 136 Il sistema immunitario adattativo attiva risposte immunitarie specifiche potenziate dalle cellule della memoria 138 L’immunità umorale dipende dalle attività di anticorpi solubili 139 Nell’immunità mediata da cellule, le cellule T riconoscono cellule che contengono frammenti di proteine estranee 141 BOX 4.4 IL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITÀ, LE PROTEINE MHC E LA PRESENTAZIONE DELL’ANTIGENE 142 Attivazione delle cellule T 144 BOX 4.5 AUTOIMMUNITÀ 145 Le peculiari organizzazione ed espressione dei geni per le Ig e i TCR 145 Ulteriori meccanismi di ricombinazione e mutazione contribuiscono alla diversità dei recettori nelle cellule B, ma non nelle cellule T 148 La monospecificità delle Ig e dei TCR è determinata da esclusione allelica e da esclusione della catena leggera 148 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 149 CAPITOLO 5 Le basi genetiche dello sviluppo 5.1 Uno sguardo generale sullo sviluppo 152 Modelli animali dello sviluppo 153 5.2 Specializzazione cellulare durante lo sviluppo 154 Le cellule si specializzano attraverso una serie irreversibile di decisioni gerarchiche 155 La scelta del destino cellulare spesso dipende dalla posizione delle cellule 156 Talvolta il destino cellulare è specificato dal tipo cellulare (lineage) più che dalla posizione 157 5.3 Formazione dello schema corporeo durante lo sviluppo 158 La formazione del piano corporeo dipende dalla specificazione degli assi e dalla polarizzazione 159 La formazione dell’architettura corporea dipende spesso da gradienti di molecole segnale 160 BOX 5.1 SPECIFICAZIONE DEGLI ASSI E DELLA POLARITÀ NELL’EMBRIONE PRECOCE DI MAMMIFERO 160 Le mutazioni omeotiche rivelano le basi molecolari dell’identità posizionale 162 5.4 Morfogenesi 164 La morfogenesi può essere guidata da cambiamenti di forma e di dimensione delle cellule 164 I principali cambiamenti morfogenetici nell’embrione sono il risultato di cambiamenti di affinità cellula-cellula 165 La proliferazione cellulare e l’apoptosi sono importanti meccanismi morfogenetici 165 5.5 Lo sviluppo precoce dell’embrione umano: dalla fecondazione alla gastrulazione 167 Durante la fecondazione l’uovo viene attivato per formare un nuovo individuo 167 Lo zigote si divide in tante cellule più piccole 168 Le cellule uovo dei mammiferi sono fra le più piccole del regno animale e le loro divisioni sono peculiari sotto vari aspetti 169 Solo una piccola frazione delle cellule dell’embrione precoce contribuirà, nei mammiferi, a formare l’organismo maturo 170 BOX 5.2 LE MEMBRANE ExTRAEMBRIONALI E LA PLACENTA 170 BOX 5.3 I GEMELLI 171 Impianto 171 La gastrulazione è un processo dinamico attraverso il quale le cellule dell’epiblasto danno origine ai tre foglietti embrionali 172 5.6 Lo sviluppo del sistema nervoso 176 Il mesoderma assiale induce l’ectoderma soprastante a svilupparsi nel sistema nervoso 176 BOX 5.4 LA STRAORDINARIA VERSATILITÀ DELLA CRESTA NEURALE DEI VERTEBRATI 177 La formazione di strutture nel tubo neurale coinvolge l’espressione coordinata di geni lungo due assi 178 Il differenziamento neuronale richiede l’attività combinatoria di fattori trascrizionali 179 5.7 Cellule germinali e determinazione del sesso nei mammiferi 180 Nei mammiferi le cellule primordiali germinali vengono prodotte precocemente nell’embrione e migrano nelle gonadi in via di sviluppo 180 La determinazione del sesso coinvolge informazioni sia intrinseche sia posizionali 180 5.8 Conservazione dei processi di sviluppo 182 Molte malattie nell’uomo sono il risultato di anomalie nei processi di sviluppo 182 I processi di sviluppo sono spesso altamente conservati, ma alcuni presentano notevoli differenze fra specie 182 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 184 CAPITOLO 6 Amplificazione del DNA: clonare il DNA con sistemi cellulari o la PCR Clonaggio di DNA utilizzando un sistema cellulare 187 La reazione a catena della polimerasi (PCR) 187 6.1 Principi di clonaggio in sistemi cellulari 187 BOX 6.1 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE E SISTEMI DI MODIFICAZIONE-RESTRIZIONE 188 I frammenti di DNA d’interesse vengono uniti alle molecole vettore mediante endonucleasi di restrizione e DNA ligasi 189 Il clonaggio del DNA in cellule batteriche sfrutta vettori che si replicano attraverso origini di replicazioni extracromosomiche 191 Il clonaggio in cellule batteriche fa uso di plasmidi e batteriofagi geneticamente modificati 192 La trasformazione costituisce la tappa chiave nel frazionamento del DNA per il clonaggio in sistemi cellulari 194 Il DNA ricombinante può essere purificato selettivamente, dopo selezione e amplificazione dei cloni cellulari con il frammento di DNA desiderato 195 6.2 Come clonare grossi frammenti di DNA e sistemi di clonaggio per produrre DNA a singolo filamento 196 I primi vettori di clonaggio per grossi frammenti di DNA sono stati costruiti sfruttando le caratteristiche del fago l 197 Grossi frammenti di DNA possono essere clonati in cellule batteriche usando repliconi extracromosomici a basso numero di copie 198 Cromosomi batterici artificiali (BAC) e fosmidi 198 Vettori e cromosomi artificiali disegnati sul fago P1 199 Gli YAC, cromosomi artificiali di lievito (yeast artificial chromosome), permettono il clonaggio di megabasi di DNA 199 Produzione di DNA a singolo filamento per il sequenziamento e la mutagenesi sito-specifica 200 I vettori M13 201 Vettori fagemidi 201 6.3 Sistemi di clonaggio progettati per l’espressione genica 203 Si possono produrre grandi quantità di proteine usando vettori di espressione in cellule batteriche 203 La tecnica del phage displayespone le proteine eterologhe sulla superficie di particelle fagiche 205 L’espressione di geni di origine eucariotica è più fedele nelle cellule eucariotiche 206 Espressione transitoria in cellule d’insetto tramite l’uso di baculovirus 207 Espressione transitoria in cellule di mammifero 207 Espressione stabile in cellule di mammifero 208 6.4 La reazione a catena della polimerasi: clonare il DNA in vitro 209 La PCR permette di amplificare una molecola di DNA specifica presente in piccolissima quantità all’interno di una popolazione complessa 210 La natura ciclica della PCR amplifica il DNA in modo esponenziale 210 L’amplificazione selettiva del DNA bersaglio dipende dall’elevata specificità delle sequenze primer 211 La tecnica della PCR come metodo di clonaggio ha dei limiti, dati dalla modesta dimensione dei frammenti amplificabili e dovuti alla bassa resa del prodotto 212 BOX 6.2 ALCUNI COMUNI METODI DI PCR 213 Per specifiche applicazioni della PCR è stata sviluppata un’ampia gamma di approcci 214 PCR allele specifica 214 Amplificazioni multiple e metodo della PCR su genoma totale 214 Mutagenesi via PCR 215 Real time PCR (qPCR, PCR quantitativa) 217 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 217 CAPITOLO 7 Ibridazione di acidi nucleici: principi e applicazioni 7.1 Principi dell’ibridazione con acidi nucleici 220 Nei saggi di ibridazione, una popolazione di molecole note di acido nucleico è utilizzata per vagliare una popolazione di acidi nucleici poco caratterizzati 220 BOX 7.1 VOCABOLARIO PER L’IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI 221 Gli eteroduplex tra sonda e bersaglio sono rilevabili più agevolmente dopo immobilizzazione su un supporto solido 221 La denaturazione e l’appaiamento sono condizionati dalla temperatura, dall’ambiente chimico e dall’estensione dei ponti idrogeno 222 Condizioni stringenti di ibridazione aumentano la specificità della formazione di molecole a doppio filamento 224 La cinetica della riassociazione del DNA dipende anche dalla sua concentrazione 224 7.2 Marcatura di acidi nucleici e oligonucleotidi 226 A partire da substrati a DNA, a RNA o oligonucleotidici, possono essere preparate differenti classi di sonde 226 Le sonde di acido nucleico lunghe sono generalmente prodotte mediante incorporazione di nucleotidi marcati nel corso della sintesi di un filamento di DNA 227 Marcatura del DNA mediante nick translation 227 Marcatura del DNA mediante random priming 228 Marcatura per sintesi di un filamento mediante PCR 228 Marcatura di RNA 228 I radioisotopi possono essere utilizzati per marcare gli acidi nucleici, ma sono pericolosi e hanno una emivita breve 229 Nella marcatura non isotopica degli acidi nucleici sono comunemente utilizzati i fluorofori 229 BOX 7.2 AUTORADIOGRAFIA 230 BOX 7.3 MARCATURA CON ELEMENTI FLUORESCENTI DI ACIDI NUCLEICI 231 7.3 Ibridazione su acidi nucleici bersaglio immobilizzati 233 L’ibridazione dot-blot permette screening rapidi e utilizza spesso sonde oligonucleotidiche allele-specifiche 233 Le ibridazioni mediante Southern e northern blot rilevano DNA e RNA frazionati in base al peso molecolare 234 Ibridazione mediante Southern blot 234 Ibridazione per northern blot 234 BOX 7.4 ELETTROFORESI DEGLI ACIDI NUCLEICI 234 In un saggio di ibridazione in situ, un campione di DNA o RNA è immobilizzato all’interno di preparati cromosomici o cellulari 235 Ibridazione in situ su cromosomi 236 Ibridazione in situ su tessuto 236 I saggi di ibridazione possono essere utilizzati per saggiare colonie batteriche contenenti DNA ricombinante 237 7.4 Saggi di ibridazione basati su microarray 238 L’ibridazione su microarray consente di effettuare saggi di ibridazione in parallelo utilizzando migliaia di sonde differenti immobilizzate 238 I microarray basati su oligonucleotidi ad alta densità forniscono strumenti estremamente potenti per l’analisi di campioni complessi di RNA o DNA 239 I microarray a oligonucleotidi di Affymetrix 240 I microarray a oligonucleotidi di Illumina 240 L’ibridazione su microarray è utilizzata principalmente per definire profili trascrizionali o analizzare variazioni a carico del DNA 240 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 242 CAPITOLO 8 Analisi della struttura e della funzione di geni e genomi 8.1 Le genoteche di DNA 244 Le genoteche di DNA genomico comprendono copie frammentate di tutte le molecole di DNA di una cellula 244 Le genoteche di cDNA comprendono le copie di DNA delle diverse molecole di RNA di una cellula 245 Le genoteche di cDNA, per essere utili, devono essere saggiate in modo appropriato e propagate 246 Come saggiare una genoteca 246 L’amplificazione e la propagazione di una genoteca 246 8.2 Il sequenziamento del DNA 247 Il metodo di sequenziamento del DNA con dideossinucleotidi prevede la sintesi enzimatica del DNA utilizzando dei terminatori base-specifici dell’allungamento della catena 248 L’automazione del sequenziamento del DNA con dideossinucleotidi ne ha aumentato l’efficienza 249 Il pirosequenziamento iterativo registra la sequenza del DNA mentre esso viene sintetizzato 250 Il sequenziamento in parallelo su larga scala del DNA permette il sequenziamento simultaneo di un gran numero di frammenti di DNA diversi 251 Il sequenziamento in parallelo su larga scala (MPS) di DNA amplificato 251 Il sequenziamento di singole molecole 252 I metodi di cattura del DNA basati sui microarray consentono un risequenziamento efficiente 255 8.3 L’anali della struttura dei genomi e i progetti genomici 256 Per il primo sequenziamento dei genomi complessi servono delle mappe di riferimento 258 L’ordine lineare dei cloni di DNA genomico in un contig (contiguo) corrisponde alle loro posizioni subcromosomiche originali 259 BOX 8.1 LE MAPPE DI RIFERIMENTO SI BASANO SU MARCATORI DI DNA E SU COnTig DI CLONI 259 Il Progetto Genoma Umano è stata un’impresa internazionale e il primo grande progetto biologico 261 Le prime mappe genetiche umane avevano una risoluzione bassa e furono costruite principalmente con marcatori di DNA anonimi 262 Le mappe fisiche del genoma umano: da mappe di marcatori a mappe di contig di cloni genomici 263 La fase finale del sequenziamento dello Human Genome Project fu una corsa al fotofinish 265 Box 8.2 LE PRINCIPALI TAPPE NELLA MAPPATURA E NEL SEQUENZIAMENTO DEL GENOMA UMANO 266 Sono stati condotti progetti genomici anche per un certo numero di organismi modello 268 Potenti banche dati genomiche e browser aiutano a immagazzinare e ad analizzare i dati genomici 269 Sono stati progettati vari programmi per predire e annotare i geni all’interno delle sequenze genomiche 270 BOX 8.3 LA RICERCA DI OMOLOGIE DI SEQUENZA 272 Ottenere stime accurate del numero dei geni umani è sorprendentemente difficile 273 BOX 8.4 LA GENE ONTOLOGY E IL CONSORZIO GO 273 8.4 Le analisi di espressione genica di base 274 I principi dei saggi di espressione genica 274 I metodi basati sull’ibridazione molecolare permettono saggi semiquantitativi e a elevata risoluzione dei trascritti di singoli geni 275 I metodi per determinare la dimensione e l’abbondanza dei trascritti basati sull’ibridazione molecolare 276 L’ibridazione di tessuti in situ 277 I metodi di PCR quantitativa sono ampiamente usati per i saggi di espressione 277 BOX 8.5 I METODI DI RILEVAMENTO USATI NELLA PCR QUANTITATIVA (REAL TIME PCR, PCR INTEMPO REALE) 278 Per seguire le proteine espresse da singoli geni si possono utilizzare anticorpi specifici 279 BOX 8.6 LA PRODUZIONE DI ANTICORPI 279 L’espressione delle proteine nelle cellule in coltura è spesso analizzata usando diversi tipi di microscopia a fluorescenza 281 8.5 Analisi in parallelo a elevata processività dell’espressione genica 282 I microarray di DNA e di oligonucleotidi permettono di determinare il profilo trascrizionale rapidamente e globalmente 282 BOX 8.7 L’ANALISI DEI DATI DI ESPRESSIONE DEI MICROARRAY 283 L’approccio moderno allo studio dei profili di espressione genica globale sfrutta sempre più il sequenziamento per quantificare i trascritti 285 L’espressione globale delle proteine è spesso rilevata mediante elettroforesi bidimensionale su gel e spettrometria di massa 286 L’elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide (2D-PAGE) 287 La spettrometria di massa 288 BOX 8.8 LA SPETTROMETRIA DI MASSA NELLA PROTEOMICA 289 Le analisi comparative dell’espressione proteica hanno molte applicazioni 290 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 291 CAPITOLO 9 Organizzazione del genoma umano 9.1 L’organizzazione generale del genoma umano 295 Il genoma mitocondriale è compatto e denso di informazione genetica 295 La replicazione del DNA mitocondriale 295 I geni mitocondriali e la loro trascrizione 296 Il codice genetico mitocondriale 297 Il genoma nucleare umano consiste di 24 molecole di DNA cromosomico molto diverse 298 BOX 9.1 LA METILAZIONE DEL DNA NEGLI ANIMALI E LE ISOLE DI CPG NEI VERTEBRATI 300 Il genoma umano contiene almeno 26 000 geni, ma il numero esatto è difficile da determinare 301 I geni umani non sono distribuiti in modo uniforme tra ed entro i cromosomi 301 La duplicazione di segmenti di DNA ha prodotto variazioni nel numero di copie e famiglie geniche 302 I meccanismi di duplicazione genica 302 9.2 I geni che codificano proteine 304 I geni umani che codificano proteine mostrano una grande variabilità per dimensione e organizzazione interna 304 Variazione della dimensione 304 Sequenze ripetute all’interno del DNA codificante 304 Proteine diverse possono essere specificate da unità di trascrizione sovrapposte 305 I geni sovrapposti e i geni all’interno di geni 305 Geni trascritti in modo divergente oppure cotrascritti da un promotore comune 307 I geni umani che codificano proteine spesso appartengono a famiglie di geni che possono essere raggruppati o dispersi su numerosi cromosomi 308 Classi diverse di famiglie geniche possono essere riconosciute in base alla similarità di sequenza e di struttura dei prodotti proteici 310 Gli eventi di duplicazione genica che danno origine a famiglie multigeniche creano anche pseudogeni e frammenti genici 311 BOX 9.2 LE ORIGINI, LA PREVALENZA E LA FUNZIONALITÀ DEGLI PSEUDOGENI 311 9.3 I geni per RNA 315 BOX 9.3 L’IPOTESI DI UN MONDO A RNA 315 BOX 9.4 REVISIONE DEL CONCETTO DI GENE NELL’ERA POST-GENOMICA 316 Oltre 1000 geni umani codificano un rRNA o un tRNA, principalmente all’interno di grandi cluster genici 318 I geni dell’RNA ribosomale 318 I geni per l’RNA transfer, o di trasferimento 320 BOX 9.5 LA SPECIFICITÀ DELL’ANTICODONE DEI TRNA CITOPLASMATICI DEGLI EUCARIOTI 321 Famiglie di geni dispersi producono vari piccoli RNA nucleari che facilitano l’espressione genica generale 322 I geni per i piccoli RNA nucleari (snRNA) dello spliceosoma 322 I geni per i piccoli RNA nucleari che non appartengono allo spliceosoma 322 I geni per i piccoli RNA nucleolari (snoRNA) 323 I geni per gli snoRNA dei corpi di Cajal 324 Circa 1000 microRNA umani diversi regolano serie complesse di geni bersaglio mediante appaiamento ai trascritti 324 BOX 9.6 L’INTERFERENZA DELL’RNA COME MECCANISMO DI DIFESA CELLULARE 325 Molte migliaia di diversi piRNA e siRNA endogeni sopprimono la trasposizione e regolano l’espressione genica 326 L’RNA che interagisce con la proteina piwi 327 I siRNA endogeni 328 Oltre 3000 geni umani sintetizzano una gran varietà di RNA di regolazione di dimensioni medio-grandi 329 9.4 DNA altamente ripetuto: eterocromatina e ripetizioni di trasposoni 331 L’eterocromatina costitutiva è in larga misura definita da lunghe serie di ripetizioni in tandem di DNA a elevato numero di copie 331 Le ripetizioni derivate dai trasposoni costituiscono oltre il 40% del genoma umano e si sono formate per la maggior parte attraverso intermedi a RNA 333 I trasposoni LTR umani 334 I fossili dei trasposoni a DNA umani 334 Alcuni elementi LINE-1 umani sono trasposoni attivi e consentono la trasposizione di altri tipi di sequenze di DNA 334 Le ripetizioni Alu sono gli elementi più numerosi del DNA umano e si originano come copie dell’RNA 7SL 335 • Conclusioni 336 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 337 CAPITOLO 10 Organismi modello, genomica comparata ed evoluzione 10.1 Organismi modello 340 Gli organismi modello unicellulari servono a comprendere la biologia cellulare di base e i microorganismi patogeni 340 BOX 10.1 CARATTERISTICHE DEI PRINCIPALI ORGANISMI MODELLO UNICELLULARI 342 Alcuni invertebrati modello consentono un’analisi genetica su vasta scala in modo economico e talvolta servono da sistemi modello per le malattie 343 BOX 10.2 CARATTERISTICHE DEI DUE PRINCIPALI MODELLI ANIMALI DEGLI INVERTEBRATI 344 Pesci, anfibi e uccelli servono egregiamente come organismi modello per lo studio dello sviluppo dei vertebrati 345 BOX 10.3 CARATTERISTICHE DEI PRINCIPALI MODELLI DEI VERTEBRATI 346 I modelli nei mammiferi presentano svantaggi a causa di limitazioni pratiche e di considerazioni etiche 347 L’uomo rappresenta l’organismo modello finale e presto probabilmente lo sarà 348 10.2 Genomica comparata 349 BOX 10.4 I PRINCIPALI MECCANISMI CHE CONTROLLANO LA VARIAZIONE DELLE FREQUENZE ALLELICHE 350 I vincoli evolutivi e il mantenimento della funzione da parte della selezione purificante 351 Sequenze a evoluzione rapida e selezione positiva 351 BOX 10.5 L’EVOLUZIONE DELLE SEQUENZE CODIFICANTI SAGGIATA MEDIANTE IL RAPPORTO Ka/Ks 352 Esistono molti software per l’allineamento automatico delle sequenze 352 La genomica comparata aiuta a confermare geni predetti e a identificare nuovi geni 353 La genomica comparata rivela che nei mammiferi è presente una quantità sorprendentemente elevata di DNA funzionale non codificante 355 La genomica comparata è stata particolarmente importante per identificare sequenze regolatrici 355 10.3 L’evoluzione dei geni e dei genomi 357 L’aumento della complessità dei geni è dovuto alla duplicazione e al rimescolamento degli esoni 358 La duplicazione degli esoni 358 Il rimescolamento degli esoni 359 La duplicazione genica può permettere di aumentare il dosaggio genico, ma la sua importanza principale sta nel consentire una complessità funzionale 360 La superfamiglia delle globine dimostra la divergenza nelle funzioni e nella regolazione dopo una duplicazione genica 361 Nei vertebrati, dopo la divisione dai tunicati, sono avvenuti due o tre eventi importanti di duplicazione del genoma 363 Durante l’evoluzione del genoma dei mammiferi sono avvenuti importanti riarrangiamenti cromosomici 364 Quando i cromosomi sessuali sono eteromorfi, quello più piccolo è limitato a uno dei due sessi, possiede pochi geni e non presenta quasi ricombinazione 366 Le regioni pseudoautosomiche si sono evolute molto rapidamente 367 I cromosomi del sesso nell’uomo si sono evoluti dopo la comparsa di un locus per la determinazione del sesso su uno degli autosomi, facendolo divergere dal cromosoma omologo corrispondente 368 L’elevato numero di geni del cromosoma Y espressi nei testicoli è mantenuto principalmente dalla conversione genica intracromosomica 370 L’inattivazione del cromosoma X si è sviluppata come risposta alla perdita di geni dal cromosoma Y 372 10.4 La posizione dell’uomo nell’albero della vita 372 BOX 10.6 GLOSSARIO DEI GRUPPI FILOGENETICI DEI METAZOI E DEI TERMINI USATI PIÙ COMUNI 373 La filogenetica molecolare si basa sull’allineamento delle sequenze per ricostruire gli alberi evolutivi 374 Esistono molti modi per costruire gli alberi evolutivi e la loro affidabilità può essere verificata con metodi statistici 374 Il paradosso del valore G: la complessità di un organismo non ha una relazione semplice con il numero dei geni codificanti proteine che possiede 377 La notevole espansione di famiglie geniche in alcune linee evolutive è spesso dovuta a geni “ambientali” 378 Nei metazoi complessi le sequenze di tipo regolativo e altre sequenze non codificanti del DNA si sono espanse in modo significativo 380 Mutazioni nelle sequenze regolatrici in cis portano a variazioni dell’espressione genica che sono alla base delle differenze morfologiche 380 Gli esoni e le sequenze regolatrici in cis tipici di una linea evolutiva si possono originare a partire da elementi trasponibili 382 L’espansione delle famiglie geniche e la perdita o l’inattivazione di geni sono avvenuti di recente nella linea evolutiva dell’uomo, ma i geni uomo-specifici sono molto rari 384 La genomica comparata e gli studi sul fenotipo cercano di identificare sequenze di DNA importanti per l’uomo 386 • Conclusioni 389 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 390 CAPITOLO 11 Espressione genica nell’uomo 11.1 I promotori e il trascitto primario 395 La trascrizione a opera della RNA polimerasi II è un processo a tappe successive 395 Definizione del promotore minimo (core promoter) e del sito d’inizio della trascrizione 396 BOX 11.1 TECNICHE PER IDENTIFICARE IL SITO D’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE 396 Assemblaggio dell’apparato di base della trascrizione 397 Allungamento del trascritto 398 Terminazione della trascrizione 398 Molte altre proteine modulano l’attività dell’apparato di base della trascrizione 398 Proteine di legame al DNA sequenza-specifiche possono legarsi vicino al promotore o in punti più lontani 399 Co-attivatori e co-repressori influenzano i promotori senza legarsi al DNA 401 11.2 Conformazione della cromatina: metilazione del DNA e codice istonico 402 BOX 11.2 NOMENCLATURA PER LE MODIFICAZIONI DEGLI ISTONI 402 Le modificazioni degli istoni nei nucleosomi possono costituire un codice istonico 403 Cromatina aperta e chiusa 403 BOX 11.3 TECNICHE PER LO STUDIO DELLA CONFORMAZIONE DELLA CROMATINA 404 Complessi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti 406 La metilazione del DNA è importante nel controllo dell’espressione genica 408 BOX 11.4 MODIFICAZIONE DEL DNA CON BISOLFITO 409 Proteine che si legano a metil-CpG 409 La metilazione del DNA durante lo sviluppo 410 Gli stati della cromatina sono mantenuti da parecchi meccanismi che interagiscono tra loro 411 Il ruolo della proteina HP1 412 Un ruolo per piccole molecole di RNA 412 Un ruolo per la localizzazione nucleare 413 Non una sola causa prima? 413 Il progetto ENCODE cerca di dare una visione globale della trascrizione e del suo controllo 413 La trascrizione è di gran lunga più estesa di quanto immaginato in precedenza 415 La previsione dei siti d’inizio della trascrizione 415 11.3 Memoria epigenetica e imprinting 416 La memoria epigenetica dipende dalla metilazione del DNA e forse dai gruppi di proteine polycomb e trithorax 416 L’inattivazione dell’X: un cambiamento epigenetico trasmissibile da una cellula alla cellula figlia, ma non da un genitore al figlio417 L’inizio dell’inattivazione dell’X: il ruolo di XIST 418 La fuga dall’inattivazione dell’X 419 A livello dei loci imprinted, l’espressione dipende dall’origine parentale 419 Le sindromi di Prader-Willi e di Angelman sono classici esempi di imprinting nell’uomo 420 A proposito dell’imprinting sorgono due domande: come avviene e perché avviene? 422 Le paramutazioni sono un tipo di cambiamento epigenetico transgenerazionale 423 Di alcuni geni è espresso solo un allele, ma indipendentemente dall’origine parentale 423 11.4 Un gene-più di una proteina 424 Molti geni hanno più di un promotore 425 Mediante uno splicing alternativo un trascritto primario può codificare isoforme multiple di una proteina 426 Un editing dell’RNA può cambiare la sequenza dell’mRNA dopo la trascrizione 427 11.5 Controllo dell’espressione genica a livello della traduzione 428 Ulteriori controlli regolano quando e dove un mRNA viene tradotto 429 La scoperta di molti piccoli RNA che regolano l’espressione genica ha determinato un cambiamento paradigmatico nella biologia cellulare 429 I microRNA come regolatori della traduzione 430 I microRNA e i tumori 431 Alcuni problemi irrisolti 431 • Conclusioni 432 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 433 CAPITOLO 12 Studiare la funzione genica nell’era post-genomica 12.1 Lo studio della funzione genica: una panoramica 436 La funzione genica si può studiare a molti livelli diversi 437 Studi di espressione genica 437 Inattivazione genica e inibizione dell’espressione genica 437 Definire i profili molecolari dei prodotti genici 438 Le analisi a livello genomico hanno il fine di integrare le analisi della funzione genica 438 12.2 Approcci bioinformatici per studiare la funzione dei geni 440 Le ricerche di omologia di sequenza possono fornire indizi preziosi sulla funzione dei geni 440 La ricerca in banche dati spesso è condotta con un modello di una sequenza evolutivamente conservata 441 BOX 12.1 LA BIOINFORMATICA PUò SVOLGERE UN RUOLO CRUCIALE NEL CHIARIRE LA FUNZIONE DEI GENI: L’ESEMPIO DEL GENE niPbL 442 Il confronto con domini e motivi proteici ben documentati può fornire indizi aggiuntivi sulla funzione del gene 442 12.3 Lo studio della funzione genica mediante inattivazione o modificazione selettiva 444 Indizi sul funzionamento di un gene si possono inferire da diversi tipi di manipolazioni genetiche 444 L’interferenza dell’RNA è il metodo principale per valutare la funzione di un gene nelle cellule di mammifero in coltura 446 Analisi globali di siRNA forniscono un approccio a livello di sistemi per studiare la funzione genica nelle cellule 448 L’inattivazione dei geni nella linea germinale fornisce le informazioni più dettagliate sulla funzione genica 449 12.4 Proteomica, interazioni proteina-proteina e interazioni proteine-DNA 451 La proteomica si occupa principalmente di identificare e caratterizzare le proteine a livello biochimico e funzionale 451 Gli studi su larga scala delle interazioni proteina-proteina cercano di definire reti proteiche funzionali 452 Il saggio del doppio ibrido di lievito si basa sulla ricostruzione di un fattore trascrizionale funzionante 452 Per selezionare i partner proteici di una proteina di interesse è ampiamente usata la spettrometria di massa con purificazione per affinità 454 Le interazioni proteina-proteina identificate sono spesso validate mediante co-immunoprecipitazione o saggi di pull-down 456 L’interattoma proteico apre un passaggio importante verso la biologia dei sistemi 456 Definire le interazioni tra acidi nucleici e proteine è fondamentale per capire la funzione dei geni 458 Mappare le interazioni proteina-DNA in vitro 459 La mappatura delle interazioni tra proteine e DNA in vivo 460 • Conclusioni 461 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 462 CAPITOLO 13 La variabilità genetica umana e le sue conseguenze’ 13.1 Tipologia delle variazioni presenti tra i genomi umani 464 I polimorfismi di un singolo nucleotide (single nucleotide polymorphism, SNP) sono le variazioni genetiche numericamente più abbondanti 464 BOX 13.1 POLIMORFISMO E MUTAZIONE: TERMINI CON DIVERSI SIGNIFICATI 465 BOX 13.2 NOMENCLATURA USATA PER DESCRIVERE VARIAZIONI DEL DNA E DELLE PROTEINE 465 Sia le sequenze intersperse, sia quelle ripetute in tandem possono mostrare polimorfismi 467 I polimorfismi dovuti a sequenze ripetute in tandem: il cavallo di battaglia per studi familiari e forensi 467 I cambiamenti su grande scala del numero di copie sono sorprendentemente frequenti nel genoma umano 468 13.2 I danni al DNA e i meccanismi di riparazione 471 Il DNA contenuto nelle cellule richiede una cura costante per riparare i danni e correggere gli errori 471 Gli effetti dei danni al DNA 473 La replicazione del DNA, la trascrizione, la ricombinazione e la riparazione del DNA utilizzano complessi multiproteici con componenti condivise 474 BOX 13.3 MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEI DANNI AL DNA NELLE CELLULE UMANE 475 I difetti nella riparazione del DNA sono la causa di molte malattie umane 476 I gruppi di complementazione 476 13.3 Varianti patogeniche del DNA 477 Capire se un cambiamento della sequenza del DNA è patogenico può essere difficile 477 Cambiamenti di un singolo nucleotide e altre piccole modificazioni sono una tipologia comune di cambiamenti patogenici 478 Mutazioni missenso 478 Mutazioni nonsenso 480 Cambiamenti che colpiscono il processamento del trascritto primario 481 Mutazioni frameshift 482 Cambiamenti che modificano il livello di espressione genica 483 Cambiamenti sinonimi (silenti) patogenici 485 Le variazioni nelle corte sequenze ripetute in tandem a volte possono essere patogeniche 485 Mutazioni dinamiche: una classe speciale di varianti microsatellitari patogeniche 486 BOX 13.4 MALATTIE CAUSATE DALL’ANORMALE AGGREGAZIONE DI PROTEINE 488 Le variazioni che alterano il dosaggio di uno o più geni possono essere patogeniche 489 13.4 Patologia molecolare: comprendere l’effetto delle variazioni 492 Una delle più grandi distinzioni della patologia molecolare è quella tra cambiamenti che determinano una perdita di funzione (loss-of-function) o un’acquisizione di funzione (gain-of-function) 493 L’eterogeneità allelica è una caratteristica frequente nei fenotipi causati da perdita di funzione 493 Mutazioni con perdita di funzione producono fenotipi dominanti se vi è aploinsufficienza 494 Quando il prodotto di un gene mutato interferisce con la funzione genica del prodotto normale si osservano effetti di dominanza negativa 496 Le mutazioni con acquisizione di funzione spesso influenzano il modo con cui un gene o il suo prodotto reagiscono ai segnali di regolazione 498 Malattie provocate dall’acquisizione di funzione di un recettore ormonale associato a una proteina G 499 Non sempre l’omogeneità allelica è dovuta a una acquisizione di funzione 499 Perdite di funzione e acquisizioni di funzione nello stesso gene producono fenotipi differenti 499 13.5 Alla ricerca delle correlazioni genotipo-fenotipo 501 L’effetto fenotipico delle mutazioni con perdita di funzione dipende dal livello residuo della funzione genica 502 La correlazione genotipo-fenotipo è particolarmente labile nel caso di malattie dovute a mutazioni mitocondriali 503 La variabilità entro famiglia è dovuta alla presenza di geni modificatori o agli effetti del caso 504 • Conclusioni 505 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 506 CAPITOLO 14 La mappatura genetica di caratteri mendeliani 14.1 Il ruolo della ricombinazione nella mappatura genetica 510 I ricombinanti vengono identificati mediante l’analisi di coppie di marcatori nei genitori e nella loro progenie 510 BOX 14.1 RICOMBINAZIONE E CONVERSIONE GENICA 511 La frequenza di ricombinazione è una misura della distanza genetica tra due loci 512 Per quanto grande possa essere la distanza tra due loci, le frequenze di ricombinazione non sono mai maggiori di 0,5 513 Le funzioni di mappatura definiscono la relazione che esiste tra frequenza di ricombinazione e distanza genetica 513 Il conteggio dei chiasmi fornisce una stima della lunghezza totale della mappa 515 Gli eventi di ricombinazione non sono distribuiti casualmente lungo i cromosomi: le distanze genetiche lungo la mappa non corrispondono alle distanze fisiche 515 14.2 Mappatura di un locus malattia 518 La mappatura delle malattie umane è basata sui marcatori molecolari 518 L’analisi di linkage richiede meiosi informative 519 I marcatori adeguati devono essere distribuiti lungo tutto il genoma 520 Nelle analisi di linkage generalmente si usano microsatelliti e SNP marcati con fluorocromi 520 14.3 La mappatura a due punti 521 Il conteggio dei ricombinanti nei pedigree non è sempre semplice 521 Il modo migliore di analizzare alberi genealogici complessi per identificare la concatenazione tra caratteri mendeliani è l’analisi computerizzata del lod score 522 Box 14.2 COME SI CALCOLA IL LOD SCORE 523 I valori di lod score di +3 e –2 fissano i criteri per determinare l’esistenza di linkage o per escluderlo (per un singolo test) 524 Box 14.3 calcolo Bayesiano del valore soglia del linkage 524 Nelle analisi dell’intero genoma è necessario usare una soglia di significatività adeguata 526 14.4 La mappatura a più punti 526 Le famiglie CEPH sono state usate per la costruzione di mappe di riferimento 527 La mappatura a più punti consente di individuare un locus malattia all’interno di una mappa di riferimento di marcatori 528 14.5 La mappatura fine che utilizza alberi genealogici allargati e aplotipi ancestrali 529 La mappatura per autozigosi consente di mappare efficientemente malattie recessive in famiglie allargate 529 L’identificazione di tratti cromosomici ancestrali condivisi permette una mappatura genetica ad alta risoluzione 530 14.6 Difficoltà legate all’analisi standard del lod score 533 Errori di genotipizzazione e diagnosi sbagliate possono generare falsi ricombinanti 533 Difficoltà di calcolo riducono il numero dei pedigree che possono essere analizzati 534 L’eterogeneità del locus costituisce sempre un’insidia per la mappatura genica nell’uomo 535 La mappatura basata sugli alberi genealogici ha una risoluzione limitata 535 I caratteri con eredità non mendeliana non possono essere mappati con i metodi descritti in questo capitolo 535 • Conclusioni 536 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 538 CAPITOLO 15 Mappatura di geni che conferiscono suscettibilità a malattie complesse 15.1 Studi familiari di malattie complesse 540 Il rapporto di rischio (l) è una misura della familiarità 541 La condivisione dello stesso ambiente familiare è una spiegazione alternativa alla familiarità 541 Gli studi sui gemelli hanno molti limiti 542 Gemelli monozigotici separati 543 Gli studi sulle adozioni sono il metodo migliore per discriminare tra fattori genetici e ambientali 543 15.2 Analisi della segregazione 544 L’analisi di segregazioni complesse consente di stimare la più probabile combinazione di fattori genetici utilizzando dati provenienti da più famiglie 544 15.3 L’analisi di linkage dei caratteri complessi 546 L’analisi standard del lod score solitamente non è indicata per lo studio di caratteri non mendeliani 546 Famiglie quasi mendeliane 547 I metodi non parametrici di analisi non richiedono un modello genetico 547 Identità per discendenza versus identità per stato 547 Analisi di fratelli affetti 548 L’analisi di linkage di caratteri complessi ha alcuni punti deboli 549 Le soglie di significatività 549 Colpi fortunati 550 Un esempio: l’analisi di linkage della schizofrenia 550 15.4 Studi di associazione e linkage disequilibrium 551 Le associazioni possono avere molte cause 553 L’associazione è molto diversa dal linkage, ad eccezione di quando la famiglia e la popolazione coincidono 554 Gli studi di associazione dipendono dal linkage disequilibrium 554 La dimensione dei tratti cromosomici ancestrali condivisi 555 Lo studio del linkage disequilibrium 556 Box 15.1 MISURE DEL LinKage disequiLibrium 557 Il progetto HapMap è lo studio più completo sul linkage disequilibrium nel genoma umano 557 Box 15.2 RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEL LinKage disequiLibrium 558 L’impiego di tag-SNP (SNP etichetta) 560 15.5 Gli studi di associazione in pratica 560 Gli studi iniziali avevano alcuni punti deboli sistematici 561 I test del disequilibrio di trasmissione evitano i problemi legati a controlli adeguati 562 Box 15.3 IL TEST DEL DISEQUILIBRIO DI TRASMISSIONE 562 Gli studi di associazione possono essere più potenti di quelli di linkage nell’identificare alleli deboli di suscettibilità 563 Negli studi di associazione i disegni sperimentali caso-controllo sono una valida alternativa a quelli TDT 563 Box 15.4 DIMENSIONE DEL CAMPIONE NECESSARIA PER IDENTIFICARE UN LOCUS DI SUSCETTIBILITÀ IN UNA SCANSIONE DELL’INTERO GENOMA 564 Particolari popolazioni possono offrire vantaggi negli studi di associazione 565 Una nuova generazione di studi di associazione sull’intero genoma (GWA) ha finalmente rotto l’impasse esistente nella ricerca sulle malattie complesse 565 La dimensione del rischio relativo 567 15.6 I limiti degli studi di associazione 568 L’ipotesi “malattia comune-variante comune” prevede che i fattori di suscettibilità abbiano origini antiche 568 L’ipotesi “mutazione-selezione” suggerisce che la maggior parte della suscettibilità a malattie sia dovuta a un’eterogenea serie di mutazioni recenti 569 Un quadro completo della suscettibilità genetica richiederà il contributo sia dell’ipotesi “malattia comune -variante comune” sia dell’ipotesi “mutazione-selezione” 571 • Conclusioni 572 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 573 CAPITOLO 16 L’identificazione dei geni e dei fattori di suscettibilità alla base delle malattie umane 16.1 Il clonaggio posizionale 577 Il clonaggio posizionale identifica un gene-malattia sulla base della sua posizione cromosomica approssimativa 578 Il primo passaggio nel clonaggio posizionale consiste nel definire la regione candidata nel modo più preciso possibile 578 Il secondo passaggio consiste nello stabilire una lista di geni nella regione candidata 579 Il terzo passaggio consiste nello stabilire un ordine di priorità fra i geni candidati, prima di ricercarne le eventuali mutazioni 580 Espressione appropriata 580 Funzione appropriata 581 Omologie e relazioni funzionali 581 Il modello murino ha un ruolo speciale nell’identificazione di geni-malattia umani 582 BOX 16.1 MAPPATURA DEI GENI MURINI 582 16.2 L’importanza dei pazienti con anomalie cromosomiche 583 Pazienti con riarrangiamenti cromosomici bilanciati e un fenotipo non spiegabile costituiscono un indizio prezioso per la ricerca 583 BOX 16.2 INDIZI DELLA PRESENZA DI ANOMALIE CROMOSOMICHE 584 Le traslocazioni del cromosoma X con un autosoma costituiscono un caso particolare 585 Riarrangiamenti che al microscopio sembrano bilanciati non sempre lo sono a livello molecolare 586 L’ibridazione genomica comparativa permette la ricerca sistematica di microdelezioni e microduplicazioni 586 Gli effetti a distanza sono il vero problema nell’identificazione dei geni-malattia 588 16.3 Strategie indipendenti dalla posizione per identificare geni-malattia 589 Un gene-malattia può essere identificato se si conosce il suo prodotto proteico 589 Un gene-malattia può essere identificato attraverso la sua funzione o le interazioni del suo prodotto 590 Un gene-malattia può essere identificato attraverso un modello animale, anche in assenza di informazioni posizionali 591 Un gene-malattia può essere identificato attraverso particolari caratteristiche della sua sequenza di DNA 592 16.4 Validazione dei geni candidati identificati con approccio posizionale 593 Per le malattie a trasmissione mendeliana, un gene candidato viene normalmente passato al vaglio alla ricerca di mutazioni in un pannello di pazienti non imparentati 593 Cambiamenti epigenetici possono causare una malattia senza alterare la sequenza del DNA 594 Il gene alla base della malattia può non essere così ovvio 595 L’eterogeneità del locus è una regola più che un’eccezione 596 Spesso sono necessari studi ulteriori per convalidare ’identificazione del gene-malattia 597 16.5 Identificazione di varianti causali attraverso studi di associazione 597 L’identificazione della varianti causali non è semplice 598 Le varianti causali vengono identificate da un approccio combinato di studi statistici e funzionali 599 L’analisi funzionale di SNP all’interno di sequenze senza funzione apparente è particolarmente difficile 600 Calpaina 10 e diabete di tipo II 600 La regione cromosomica 8q24 e la suscettibilità al tumore della prostata 601 16.6 Otto esempi di identificazione di geni-malattia 602 Caso-studio 1: la distrofia muscolare di Duchenne 602 Caso-studio 2: la fibrosi cistica 604 Caso-studio 3: la sindrome brachio-oto-renale 605 Caso-studio 4: la deficienza multipla di solfatasi 606 Caso-studio 5: la persistenza della lattasi intestinale 607 Caso-studio 6: la sindrome CHARGE 609 Caso-studio 7: il tumore al seno 610 Caso-studio 8: il morbo di Crohn 612 16.7 L’identificazione dei geni-malattia ha funzionato? 616 La maggior parte delle varianti che causano le malattie a trasmissione mendeliana è stata identificata 616 Gli studi di associazione su scala genomica hanno avuto molto successo, ma resta difficile identificare le varianti che hanno un reale ruolo funzionale 617 Sono stati raggiunti risultati clinicamente utili solo per poche malattie complesse 617 La malattia di Alzheimer 618 Degenerazione maculare legata all’età (ARMD, age related macular degeneration 618 Eczema (dermatite atopica 619 Il problema dell’ereditabilità nascosta 619 • Conclusioni 620 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 621 CAPITOLO 17 Genetica del cancro 17.1 L’evoluzione del cancro 625 BOX 17.1 DUE MODALITÀ PER RENDERE PIÙ PROBABILE UNA SERIE DI MUTAZIONI SUCCESSIVE 626 17.2 Gli oncogeni 627 Gli oncogeni agiscono nelle vie di segnalazione della crescita 628 L’attivazione di un oncogene implica un acquisto di funzione 629 Attivazione mediante amplificazione 629 Attivazione da mutazioni puntiformi 630 Attivazione mediante traslocazioni che creano un nuovo gene chimerico 631 Attivazione mediante traslocazioni in regioni cromatiniche trascrizionalmente attive 632 L’attivazione di un oncogene risulta tumorigenica solamente in circostanze particolari 633 17.3 I geni oncorepressori 633 Lo studio del retinoblastoma ha fornito un paradigma per la comprensione dei geni oncosoppressori 634 Alcuni geni oncosoppressori mostrano variazioni rispetto al paradigma dei due eventi 635 La perdita di eterozigosi è stata ampiamente utilizzata come marcatore per localizzare i geni oncosoppressori 637 I geni oncosoppressori sono spesso silenziati epigeneticamente mediante metilazione 638 17.4 La regolazione difettosa del ciclo cellulare nel cancro 638 Tre geni oncosoppressori principali controllano gli eventi cellulari nella fase G1 640 pRb: un regolatore cruciale della progressione attraverso la fase G1 640 p53: il guardiano del genoma 641 CDKN2A: un singolo gene codificante due proteine regolatrici 641 17.5 L’instabilità del genoma 642 Per indagare le alterazioni cromosomiche nelle cellule tumorali si utilizzano diversi approcci sperimentali 643 Tre meccanismi principali sono responsabili dell’instabilità cromosomica e delle anomalie del cariotipo 643 I telomeri sono essenziali per la stabilità cromosomica 644 I danni al DNA inviano un segnale a p53, che avvia una risposta protettiva 645 ATM: il rilevatore iniziale del danno 645 La nibrina e il complesso MRN 646 CHEK2: una chinasi mediatrice 646 Il ruolo di BRCA1/2 646 p53 alla riscossa 647 I difetti nei meccanismi di riparazione sono alla base di numerose malattie genetiche associate al cancro 647 L’instabilità dei microsatelliti è stata scoperta in seguito alle ricerche sui tumori familiari del colon 648 17.6 Una visione genomica del cancro 650 Le analisi citogenetiche e l’ibridazione su microarray consentono una visione su scala genomica delle alterazioni strutturali 650 Le nuove tecniche di sequenziamento permettono di rilevare cambiamenti della sequenza nucleotidica su scala genomica 650 Ulteriori tecniche forniscono una visione su scala genomica delle alterazioni epigenetiche nei tumori 651 L’indagine dell’espressione genica su scala genomica viene utilizzata per generare modelli di espressione 652 17.7 Lo studio dell’evoluzione a più stadi del cancro 654 La microevoluzione del tumore al colon-retto è particolarmente ben documentata 654 17.8 L’integrazione dei dati: il cancro come un problema di biologia cellulare 656 La tumorigenesi dovrebbe essere concepita in termini di pathway, non di singoli geni 657 I tumori maligni devono acquisire la capacità di stimolare l’angiogenesi e la metastatizzazione 658 La biologia dei sistemi consentirà di arrivare a una visione unificata dello sviluppo tumorale 659 • Conclusioni 660 CAPITOLO 18 Test genetici 18.1 Che cosa analizzare e perché 665 Per l’analisi genetica possono essere usati molti tipi diversi di campioni 665 RNA o DNA? 666 Saggi funzionali 667 18.2 Scansione di un gene alla ricerca di mutazioni 667 La scansione di un gene alla ricerca di mutazioni normalmente viene fatta mediante sequenziamento 667 Per analizzare rapidamente un gene alla ricerca di possibili mutazioni sono state usate diverse tecniche 668 Metodi basati sull’identificazione di mismatch o eteroduplex 669 Metodi basati sull’analisi della conformazione dei singoli filamenti 670 Metodi basati sulla traduzione: il test delle proteine tronche 671 I microarray consentono con una sola operazione la scansione di un gene alla ricerca praticamente di qualsiasi mutazione 671 La metilazione del DNA può essere messa in evidenza mediante molti metodi 672 Le varianti non classificate rappresentano un problema rilevante 673 18.3 Ricerca di uno specifico cambiamento di sequenza 674 Ricerca della presenza o assenza di un sito di restrizione 674 Ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici 676 Amplificazione allele-specifica mediante PCR 676 Saggio di ligazione degli oligonucleotidi 677 Minisequenziamento mediante primer extension 677 Pirosequenziamento 677 Genotipizzazione mediante spettrometria di massa 679 Genotipizzazione massiva di SNP in parallelo basata su microarray 679 18.4 Alcuni test speciali 681 L’analisi di delezioni e duplicazioni di un intero esone richiede delle tecniche speciali 681 Il test di amplificazione multiplex con sonde ligazione-dipendente (MLPA) 682 Delezioni del gene della distrofina nei maschi 683 Non maternità apparente in una famiglia in cui segrega una delezione 684 Nei test prenatali per aneuploidie cromosomiche viene usata una PCR quantitativa 684 Alcune malattie da espansione di triplette richiedono dei test speciali 685 Per alcune malattie l’analisi delle mutazioni deve tener conto della variabilità geografica 686 Il test per malattie con un’elevata eterogeneità di locus rappresenta una sfida 688 18.5 Gene tracking 689 Il gene tracking implica tre passaggi logici 689 BOX 18.1 LA LOGICA DEL gene TraCKing 690 La ricombinazione pone un serio limite alla precisione del gene tracking 691 Il calcolo del rischio nel gene tracking 691 BOX 18.2 L’USO DEL TEOREMA DI BAYES PER COMBINARE LE PROBABILITÀ 692 I problemi particolari relativi alla distrofia muscolare di Duchenne 693 18.6 Determinazione del profilo di DNA (DNA profiling) 693 Per il profiling è stata usata una grande varietà di differenti polimorfismi del DNA 694 Uso di sonde minisatelliti per il fingerprinting del DNA 694 L’uso di marcatori microsatelliti per il DNA profiling 695 Polimorfismi del cromosoma Y e mitocondriali 696 Il DNA profiling è utilizzato per escludere o stabilire una paternità 696 Il DNA profiling può essere utilizzato per identificare l’origine di campioni clinici 696 Il DNA profiling può essere usato per determinare il tipo di gemellarità 697 Il DNA profiling ha rivoluzionato le indagini forensi ma solleva problemi relativi alle libertà civili 697 Problemi tecnici 697 Problemi giudiziari 698 BOX 18.3 L’ERRORE ACCUSATORIO 699 Problemi etici e politici 700 Conclusioni 701 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 703 CAPITOLO 19 Farmacogenetica, medicina personalizzata e screening delle popolazioni 19.1 Valutazione dei test clinici 706 BOX 19.1 LO SCHEMA ACCE PER LA VALUTAZIONE DEI TEST 706 La validità analitica di un test è misura della sua accuratezza 707 BOX 19.2 MISURA DELLA VALIDITÀ ANALITICA DI UN TEST 707 La validità clinica di un test è misurata dalla bontà della previsione riguardante una condizione clinica 707 I test devono essere valutati anche per l’utilità clinica e l’accettabilità sotto l’aspetto etico 708 BOX 19.3 MISURE DEL RISCHIO RELATIVO 709 19.2 Farmacogenetica e farmacogenomica 710 Molte differenze a livello genetico hanno effetto sul metabolismo dei farmaci 711 I citocromi P450 sono responsabili di gran parte del metabolismo di Fase 1 dei farmaci 711 CYP2D6 712 Altri enzimi P450 713 Un’altra variante di un enzima di Fase 1 causa problemi in chirurgia 714 Le reazioni di coniugazione della Fase 2 producono derivati idrosolubili dei farmaci, che vengono escreti 714 Acetilatori lenti e veloci 714 La glucuronosiltransferasi UGT1A1 715 Le glutatione-S-transferasi GSTM1 e GSTT1 715 Tiopurina metiltransferasi 716 La variabilità genetica del bersaglio può avere effetto sulla farmacodinamica 716 Variabilità dei recettori beta-adrenergici 716 Variabilità dell’enzima convertitore dell’angiotensina 716 Variabilità del recettore HT2RA della serotonina 717 Ipertermia maligna e il recettore per la rianodina 718 19.3 Medicina personalizzata: prescrivere il farmaco migliore 718 La difficoltà di mettere in pratica la teoria senza una genotipizzazione del paziente 718 Gli effetti dei farmaci sono spesso poligenici 718 Warfarina 719 Le industrie farmaceutiche non hanno finora avuto grossi incentivi per promuovere una medicina personalizzata 720 Stadi nello sviluppo di un farmaco 720 Alcuni farmaci sono progettati o venduti su licenza per il trattamento di pazienti con genotipi specifici 721 Il trastuzumab per il tumore alla mammella con amplificazione di HER2 722 Il gefitinib per il tumore al polmone e altri tumori in presenza di mutazioni EGFR 722 Il profilo di espressione dei tumori può portare a un trattamento personalizzato 723 Un approccio alternativo: la medicina depersonalizzata e la polipillola 724 19.4 La medicina personalizzata: studi sulla suscettibilità a malattie complesse 725 I ricercatori riescono finalmente a identificare i fattori genetici di suscettibilità 725 I fattori individuali sono quasi sempre poco rilevanti 726 Anche se un test singolo non fornisce una previsione accurata, una batteria di test potrebbe riuscirci 727 Rimane molto da capire circa la validità clinica dei test di suscettibilità 729 Il rischio per il diabete di tipo 2: lo studio Framingham e uno studio sugli Scandinavi 729 Rischio di tumore alla mammella: lo studio del gruppo Pharoah 729 Il rischio di tumore alla prostata: lo studio del gruppo di Zheng 731 Le prove di un’utilità clinica dei test per la suscettibilità mancano quasi completamente 732 19.5 Lo screening di popolazione 733 I test di screening non sono test diagnostici 734 Lo screening prenatale per la sindrome di Down stabilisce una soglia arbitraria per il test diagnostico 734 I test di screening devono rispondere a determinati criteri per essere accettati 735 Che cosa si vuole ottenere con uno screening? 736 Sensibilità e specificità 736 Scelta dei soggetti per lo screening 738 Una linea guida etica per lo screening 738 Alcune persone temono che i programmi di screening prenatale possano portare all’ostracismo delle persone affette 739 Alcune persone temono che permettere alle persone con malattie genetiche di condurre una vita normale avrà conseguenze negative sulle generazioni successive 739 19.5 Il nuovo paradigma: prevedere e prevenire? 740 Conclusioni 742 LeT Tu r e dI A P PrOfOn dIm e nT O 743 CAPITOLO 20 Manipolazione genica di animali per lo studio di modelli di malattia e di funzione genica 20.1 Una panoramica sugli organismi modello 746 Una vasta gamma di spe |
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